Conception d'un format alternatif de fragment d'anticorps pouvant être produit dans le cytoplasme d'Escherichia coli

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 14188 (2023) Citer cet article

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Avec une accessibilité et une pénétration tissulaire accrues, des formats d’anticorps plus petits tels que les fragments d’anticorps (Fab) et les fragments variables à chaîne unique (scFv) présentent un potentiel comme choix efficace et peu coûteux par rapport aux anticorps complets. Ces formats issus de l’architecture modulaire des anticorps pourraient s’avérer révolutionnaires pour certaines applications thérapeutiques et diagnostiques. Les hôtes microbiens se sont révélés extrêmement prometteurs en tant qu’hôtes de production pour les formats de fragments d’anticorps. Cependant, les faibles rendements en protéines cibles, associés à la complexité du repliement des protéines, entraînent des limitations de production. Nous rapportons ici un format alternatif de fragment d’anticorps « FabH3 » conçu pour surmonter certains goulots d’étranglement clés associés au repliement et à la production de Fab. La molécule FabH3 est basée sur le format Fab avec les domaines constants remplacés par des domaines CH3 d'immunoglobuline G1 (IgG1) modifiés capables d'hétérodimérisation basée sur l'approche de pilotage électrostatique. Nous montrons que ce format alternatif de fragment d'anticorps peut être produit efficacement dans le cytoplasme d'E. coli en utilisant le système de formation de liaisons disulfure catalysée (CyDisCo) dans un état nativement replié avec des rendements solubles plus élevés que son homologue Fab et une affinité de liaison comparable contre le antigène cible.

Parmi les produits biothérapeutiques, le segment des anticorps monoclonaux (Mabs) occupe une position dominante sur le marché, mais cette tendance semble évoluer progressivement avec le développement de nouveaux formats d'anticorps et de nouveaux médicaments1. Les anticorps monoclonaux complets ont une longue demi-vie en circulation, ce qui pourrait les rendre impropres à certaines applications thérapeutiques et diagnostiques2. En tant que solution potentielle, les fragments d’anticorps (Fabs) sont devenus des acteurs clés de l’industrie biopharmaceutique. Ils offrent certains avantages tels qu'une pénétration tumorale améliorée et profonde, une liaison à des épitopes spécifiques inaccessibles aux Mabs, une liaison à l'antigène monovalent avec une immunogénicité potentiellement réduite, une stabilité supérieure à celle des formats de fragments d'anticorps plus petits et une clairance plus rapide3,4,5. Une multitude d’applications de molécules à base d’anticorps en tant qu’agents thérapeutiques et diagnostiques ont intensifié leur demande et par conséquent la nécessité de leur production avec des rendements élevés.

De nombreux produits biosimilaires et de type « moi aussi » approuvés ont été produits dans des systèmes d'expression microbienne parmi lesquels E. coli est resté un choix privilégié6. Comme les fragments d'anticorps Fab et scFv sont non glycosylés et relativement petits, leur production dans E. coli peut être plus simple et plus viable économiquement que les systèmes de culture de cellules de mammifères conventionnels. Les fragments d'anticorps sont des protéines à liaison disulfure qui sont traditionnellement produites par recombinaison dans le périplasme oxydant ou sous forme de corps d'inclusion dans le cytoplasme réducteur d'E. coli. Cependant, les deux approches posent des goulots d’étranglement critiques dans la production efficace de ces protéines d’intérêt. L'expression périplasmique des Fabs entraîne souvent de faibles rendements en protéines, principalement en raison d'une translocation protéique inefficace et du petit volume du périplasme, tandis que l'expression cytoplasmique est confrontée à des limitations en termes de dégradation des protéines à l'état non natif et d'agrégation en corps d'inclusion. Parmi les sept Fab commercialisés, deux sont produits dans E. coli sous forme de corps d'inclusion3,7. Le repliement des Fab est un processus complexe, impliquant la formation de liaisons disulfure, l'isomérisation cis-trans-prolyle et l'oligomérisation contrôlée. Par conséquent, le repliement des corps d'inclusion est souvent inefficace et coûteux8.

Les fragments Fab sont composés de deux chaînes polypeptidiques liées de manière covalente, à savoir les chaînes lourdes (HC) et légères (LC) qui contiennent respectivement deux domaines constants CH1 et CL et deux domaines variables de liaison à l'antigène VH et VL (Fig. 1A). Le domaine CH1 est une protéine intrinsèquement désordonnée isolée et reste dans un état déplié quelle que soit la formation de liaisons disulfure9. L’une des étapes critiques limitant le taux de repliement des fragments d’anticorps est l’association des domaines constants, car le domaine CH1 adopte le pli typique des immunoglobulines (Ig) uniquement lors de l’interaction avec le domaine CL9,10. De plus, la faible stabilité de HC associée à la formation de dimères LC liés de manière covalente et non covalente justifie la nécessité d'équilibrer la synthèse des deux chaînes . La conception et le criblage de constructions avec des forces de traduction variables de LC et HC pour une expression optimale de Fab peuvent être laborieuses, coûteuses et ne conduisent pas nécessairement au succès. Il existe plusieurs approches pour conduire une hétérodimérisation efficace dans une molécule Fab, par exemple Ojima-Kato et al. ont rapporté la fusion de paires de peptides leucine-zipper avec les domaines constants (Zipbody)13. Cependant, cela limite l’application thérapeutique des Fab en raison de la nécessité d’étapes de clivage des étiquettes et des problèmes d’immunogénicité qui en découlent.